Wetenschappelijke doorbraak|Scheidings- en zuiveringsproces voor recombinant gehumaniseerd collageen type II

Type II collageen is een structureel eiwit dat voornamelijk in kraakbeenweefsel wordt aangetroffen. Het biedt ondersteuning en demping voor gewrichten en helpt de mechanische eigenschappen en structurele integriteit van kraakbeen te behouden. Het heeft een aanzienlijk toepassingspotentieel in de gewrichtsgezondheidszorg en de manipulatie van kraakbeenweefsel.

 

Vergeleken met traditionele extractiemethoden biedt recombinant collageen geproduceerd door microbiële gastheerfermentatie een stabiele kwaliteit, goede biocompatibiliteit en geen risico op virale besmetting, waardoor het een belangrijk onderzoeksfocus is. Recombinant gehumaniseerd Type II collageen geproduceerd door fermentatie met behulp van gemanipuleerde *Pichia pastoris* heeft aanzienlijke onderzoeksinteresse gewekt. De hoge kosten en complexiteit van scheiding en zuivering blijven echter grote uitdagingen bij het opzetten van een efficiënt proces voor de productie op industriële- schaal van recombinant collageen.

 

Een onderzoeksteam van de School of Life Sciences and Medical Engineering aan de Anhui Universiteit heeft, in samenwerking met Anhui Zhongsheng Anlan Health Industry Co., Ltd., een compleet scheidings- en zuiveringsproces ontwikkeld voor recombinant gehumaniseerd Type II collageen II-23k op basis van Tangential Flow Filtration (TFF) gecombineerd met DEAE zwakke anion-uitwisselingskolomchromatografie in flow--modus, wat een haalbare oplossing biedt voor productie op grote schaal.

 

Compleet zuiveringsproces op industriële-schaal

Het hele proces bestaat uit vier grote stappen:

Verduidelijking Filtratie → Concentratie en diafiltratie → DEAE-kolomstroom-Door middel van chromatografie → Bevriezen-Drogen

 

Figuur 1. Scheidings- en zuiveringsproces voor recombinant gehumaniseerd type II collageen II-23k

 

Screening van sleutelprocessen

Het onderzoeksteam vergeleek vier soorten ionen-uitwisselingschromatografiemedia: Q sterke anion-uitwisseling, DEAE zwakke anion-uitwisseling, SP sterke kation-uitwisseling en CM zwakke kation-uitwisselingskolommen.

 

Among them, the DEAE weak anion-exchange column showed the best performance. Under a buffer condition of pH 7.0 , the column was operated in flow-through mode , achieving a target protein purity of >95% and a recovery rate of >90%, zonder dat er resterende pigmenten worden gedetecteerd.

 

De scheidings- en zuiveringsprocessen voor verschillende recombinante collagenen die door verschillende microbiële gastheren tot expressie worden gebracht, variëren aanzienlijk. Over het algemeen kan de algehele strategie echter worden onderverdeeld in primaire scheiding en fijne zuivering.

 

Het doel van de primaire scheiding is het verwijderen van vast zwevend materiaal zoals microbiële cellen en het voorbereiden van de fermentatiebouillon voor daaropvolgende fijne zuivering. Deze fase omvat voornamelijk centrifugeren en filtratie. Conventionele industriële centrifuges zijn over het algemeen groot van formaat, duur en beperkt in rotatiesnelheid, wat resulteert in een relatief lage verwerkingsefficiëntie. Tangentiële stroomfiltratie (TFF) heeft lagere bedrijfskosten en vermindert effectief de verstopping en vervuiling van membranen die gepaard gaan met conventionele doodlopende filtratie. Daarom wordt TFF op grote schaal toegepast bij de klaringsfiltratie en concentratie/diafiltratie van fermentatiebouillons die recombinante eiwitten bevatten.

 

Het doel van fijne zuivering is om de productzuiverheid verder te verbeteren door onzuiverheden zoals gastheerceleiwitten en pigmenten te verwijderen door middel van chromatografische technieken. Van deze technologieën biedt ionenuitwisselingschromatografie een hoge resolutie en sterke selectiviteit en wordt op grote schaal gebruikt voor de productie op grote schaal- van verschillende biomoleculen.

 

Bij industriële productie stelt ionenuitwisselingschromatografie relatief hoge eisen aan monsterhelderheid en ionensterkte. Ondertussen kan TFF grote hoeveelheden voedermateriaal verwerken, is het gemakkelijk te onderhouden en biedt het een goede schaalbaarheid, waardoor het breed inzetbaar is voor stroomafwaartse zuiveringsprocessen voor bioproducten.

 

Daarom werd bij het vaststellen van het scheidings- en zuiveringsproces voor II-23k een TFF-hollevezelmembraan van 0,22 μm gebruikt voor klaringsfiltratie van de fermentatiebouillon om microbiële cellen en andere vaste onzuiverheden te verwijderen. Vervolgens werd een TFF-membraancassette met vlakke--platen van 5 kDa gebruikt voor concentratie en diafiltratie, waarbij de voorbehandeling voorafgaand aan de chromatografie werd voltooid. Ten slotte werd voor de zuivering DEAE-kolomchromatografie in doorstroommodus gebruikt.

 

De resultaten toonden aan dat het proces effectief presteerde en een zuiverheid van het eindproduct van ongeveer 95% bereikte, zonder dat er achtergebleven pigmenten werden gedetecteerd. Het totale herstelpercentage van het volledige proces bereikte bijna 60%.

 

Verdere verbeteringen in de terugwinning kunnen worden bereikt door het voedingsvolume te vergroten en de drukmeter van de membraancassette tijdens de concentratie- en diafiltratiefase te verlagen. Het herstel van de chromatografiestap kan mogelijk worden verbeterd door de bedrijfstemperatuur van de chromatografie te verlagen en de zoutionenconcentratie in de buffer te verhogen.

 

Referentie

Meng Zixuan, Shi Weiwei, Zhang Maifei, et al. Scheidings- en zuiveringsproces voor recombinant gehumaniseerd collageen type II. *Chinese Journal of Biology*, 2026, 43(1): 91–96.